cell: 肥胖塑造肿瘤微环境中的代谢并抑制抗肿瘤免疫-k8凯发

作者将5周龄的c57bl/6j小鼠随机分为正常饮食组（cd, control diet）与高脂饮食组（hfd），8-10周后hfd组的小鼠体重增长更多，且显示了肥胖相关的代谢变化（图1a）。之后，注射mc38 结直肠腺癌细胞，mc38肿瘤在hfd小鼠中生长更为迅速（图1b）。此外，作者还用另外三种不同免疫原性水平的肿瘤模型进行比较，高免疫原性的e0771乳腺肿瘤在hfd动物中生长更快（图1c）；中等免疫原性的b16黑色素瘤在hfd组中的的生长速度稍增加（图1d），而低免疫原性的lewis肺癌的增长速度并不随饮食改变（图1e）。

为探究cd组中肿瘤生长速率的降低是否由t细胞导致，作者在tcrα敲除（tcrα-ko）小鼠中种植mc38肿瘤。tcrα-ko小鼠与野生型小鼠在高脂饮食后体重增长相似，但在tcrα-ko小鼠中cd组与hfd组的mc38肿瘤的增长速度并无区别（图1f）。

同样对于cd8 t细胞清除的小鼠而言，不同的饮食分组对肿瘤生长速率无影响（图1g）。

作者对cd与hfd组肿瘤中的细胞进行无偏倚聚类分析，识别出了16个不同的细胞群（图3b）。hfd组中的淋巴细胞显著减少，但免疫抑制性髓样细胞的相对比例无明显变化（图3c）。来自cd组肿瘤的白细胞富集糖代谢及氧化还原途径，而hfd组则富集脂肪胆固醇代谢、叶酸合成、戊糖与葡糖醛酸转换相关途径（图3d）。作者计算了两组不同细胞集的kegg代谢特征得分（图3e-3g），亚群6（单核细胞）, 亚群8（t细胞）, 亚群10（m2 tams）对hfd尤为敏感。

之后作者分析了参与代谢调节和免疫活性的kegg信号特征，hfd组t细胞亚群中趋化因子信号和t细胞受体信号都显著减少（图3h、3i）。作者又将t细胞分类进行分析，发现cd组中 cd8 t细胞中代谢途径更为富集，这些与t细胞活化相关（图3k）。

当作者对tim3细胞毒性cd8  t细胞进行差异表达分析时，正常饮食组富含cd8  t细胞的前五个基因参与t细胞效应器功能，包括gzmb、tnfrsf9、ifng、ccl3和ccl4（图3l）。总的来说，与未受刺激的t细胞相关特征往往富集在hfd组，而与受刺激的t细胞相关特征则富含在cd组（图3m）。为了确定t细胞刺激信号得分较高的细胞是否在特定代谢信号得分较高，作者计算了t细胞刺激信号与cd组和hfd组内 cd8  t细胞的一组核心kegg代谢途径之间的相关性。事实上，代谢途径与hfd 组内tme中的t细胞活化更显著相关（图3n）。总之，单细胞谱分析显示tme中的免疫细胞在hfd组中经历独特的代谢适应，并且差异在t细胞中是独特的，t细胞显示主要中心碳代谢途径的表达改变。 

cd8 t细胞杀伤肿瘤细胞需要直接的细胞间接触以及足够的代谢资源。因此作者试图探究肥胖是否会影响tils在tme中的位置，以及t细胞在肿瘤中的位置是否与肿瘤内代谢生态位变化相关。作者根据标记物表达模式和代谢特征来判定细胞簇（图4a-b），使用循环免疫荧光技术（cycif）绘制tme中细胞位置和状态，共识别出9个不同的细胞型（图4c）。发现hfd组肿瘤中cd8 t细胞更少且t细胞并不集中于肿瘤边缘（图4sc）。

作者发现两组糖酵解标志物(glut1, pkm2, ldh)分布不同（图4d）。为确定这种代谢状态的差异是否与免疫细胞的空间分布相关，作者测量了免疫细胞群与glut1或aco2高表达的肿瘤区域之间的重叠，将位于肿瘤内高glut1或高aco2区域的cd8 t细胞的比例(图4e和4f)与涉及相同数量cd8 t细胞的模拟零分布进行了比较(图4g)，发现cd4 和cd8 t细胞在高glut1区域实际分布较模拟分布显著减少（图s4f、s4g）。作者还发现hfd组较cd组，cd8 与cd4 t细胞和glut1重叠减少(图4h和4i)，尤其是cd8 t细胞。因此认为hfd影响了肿瘤中t细胞的浸润模式。 

在增殖、生存、产生效应功能方面，cd8 t细胞与肿瘤细胞依赖于许多同样的代谢途径。作者对gfp  mc38 肿瘤细胞、cd8  tils、引流淋巴结（dln）中的cd8  t进行bulk rna-seq。主成分分析显示了来自于肿瘤和dln的t细胞，以及cd组和hfd组tils的不同（图5a），提示肥胖所致cd8 t细胞改变为tme特有。为理解cd8 t细胞的tme特异适应性反应，作者研究了cd8  tils转录水平的变化，四个基因在hfd组的表达显著不同，其中三个为脂肪合成或胆固醇代谢相关elovl6、dgat1、ldlrap1（图5b）。cd8 tils转录水平变化与肿瘤细胞不重叠(图5c-5f)，提示二者对hfd有不同的代谢适应。作者发现hfd肿瘤细胞在基因表达上向促进脂肪酸氧化（fao）改变（图5g），而cd  tils并非如此（图5h）。此外，hfd组mc38肿瘤细胞的糖酵解基因转录水平比cd8 tils下降更多(图5i和5j)。因此，肿瘤细胞和cd8 tils对hfd的代谢适应，包括脂肪代谢的变化，都有所不同。

作者发现两个饮食组中的cd8 tils和mc38肿瘤细胞在中性脂水平相似（图5k、5l）。

来自hfd小鼠肿瘤细胞比cd组的摄取更多的脂肪酸（图5m）。作者推断肿瘤内脂肪利用的变化会影响该微环境下cd8 t细胞的脂肪摄取。进一步的试验发现不同的饮食没有改变dln中cd8 t细胞的基线棕榈酸酯摄入（图5n、5o），但hfd组中的, cd44  cd8  tils比cd组摄取的棕榈酸酯更少（图5n、5p）。b16-ova-rfp及e0771肿瘤中也有类似的发现（图5q-5s）。因此，肿瘤细胞适应并增加脂肪酸利用，而cd8 t细胞没有增加利用。肿瘤细胞脂肪酸摄取增强可能导致在tme中的t细胞缺少脂肪酸。对于在体外缺少脂肪酸的培养基中被激活的初始cd8 t细胞，在有脂肪酸补充时能更好地增殖（图5t-u）。相反，补充游离脂肪酸并不影响mc38肿瘤细胞的增殖（图s5j）。综上，tme中不同细胞群对肥胖有不同的反应，导致免疫细胞和肿瘤细胞对脂肪酸利用的不同。 

作者发现，脂肪酸代谢和氧化磷酸化是hfd肿瘤细胞中最富集的代谢途径；此外，相对于cd，hfd中的ifnγ反应降低，这可以通过cd8 t细胞浸润的减少来解释（图6b）。hfd通过诱导转运体（slc27a1）、脂肪酸结合蛋白（fabp5）和参与线粒体氧化的蛋白质（cpt1a、acsm3、acadvl、etfb、echs1）（图6c、6d和6f）来支持肿瘤中的脂肪利用。hfd组中催化不可逆和（或）限速步骤的糖酵解酶被下调（图6c-6f）

作者比较了血浆、gfp  mc38肿瘤细胞、肿瘤间质液（tif）中的脂质构成。hfd对血浆和tif中脂质的影响更大（图s6f-s6h），hfd组和cd组所有脂质的tif/血浆比成正相关，甘油三酯（tag）和甘油二酯（dag）在对角线外，在去除了这两类脂后hfd组和cd组相关性更好，提示dag和tag是hfd组tme中脂质主要的不同（图s6i-s6n）。tag和dag中的前四名（按峰值计）在hfd的tif中显著富集，但在血浆中没有富集（图6g-6j）。 

作者发现hfd重新编程tme以增强肿瘤中的脂肪摄取，因此假设这些hfd诱导的肿瘤细胞脂肪代谢的变化可能会影响tme中的游离脂肪酸（free fatty acids，ffas）可用性和cd8 t细胞的功能，并进一步假设阻止hfd诱导的代谢改变可能会恢复cd8 t细胞的反应并抑制hfd组肿瘤生长的增加。

hfd增加了许多ffas在循环中的水平，包括棕榈酸和油酸（c16：0和c18：1）（图7b、7c）。而与cd组相比，hfd组tif的局部ffa水平降低（图7d）。phd3过表达对cd组tif的ffa水平无显著影响（图7e），但hfd组中一些ffa有所增加（图7f）。肿瘤细胞phd3过表达足以恢复tme中棕榈酸盐的可用性（图7g）。

因此，恢复肿瘤细胞中phd3表达能改变tme中的营养可用性。

肿瘤细胞phd3过表达显著增加hfd组cd8 t细胞浸润（图7j），hfd组中phd3过表达（phd3-oe）较之对照（ev）显著减缓肿瘤的生长（图7k）。在tcra-ko小鼠和cd8 t细胞清除的小鼠中phd3过表达并不减缓肿瘤生长（图7l、7m）。这些数据表明，在mc38肿瘤细胞中保持phd3高表达可以改善hfd小鼠的抗肿瘤t细胞反应，并减轻hfd对抗肿瘤免疫的影响。

作者分析了tcga（the cancer genome atlas）中结肠腺癌(coad)rna-seq数据集和相应的bmi数据，在bmi≥30kg/m2的肥胖患者中，phd3的表达明显较低（图7n），coad患者的癌组织中phd3表达较正常组织减少（图7o）。此外，严重肥胖（bmi≥35kg/m2）患者肿瘤中cd8 t细胞浸润减少（图7p）。以phd3表达为10%或20%作为切割点，将患者样本分为高phd3或低phd3组。然后，根据cd8 基因特征得分，将患者样本分为免疫学上的“热”、“中间”或“冷”类别（图7q）。在coad冷肿瘤中phd3表达更低（图s7n），在其他类型的肿瘤中，低phd3样本也更多出现于冷肿瘤中（图s7o）。

这些数据表明，phd3的下调发生在人类癌症中，并与免疫力的降低有关。