虎眼万年青多糖增强5-k8凯发

编译：微科盟r. a，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

5-fu治疗会限制肿瘤细胞的生长并通过广泛的 dna 损伤导致细胞凋亡。可是，许多 crc 患者最终对 5-fu 产生化学抗性。然而，5-fu不专门针对肿瘤细胞，因此也会对正常细胞造成损害，从而导致潜在的严重不良反应。此外，5-fu治疗还可以改变肠道微生物群，这会影响肠道屏障功能并引发结肠炎症。

肠道菌群在维持肠道稳态、粘液屏障完整性、宿主免疫反应、药物毒性和抗癌药物反应中起着至关重要的作用。多糖被认为是潜在的益生元，对宿主肠道健康具有有益影响，并可减轻化疗引起的肠道粘膜炎。多糖的抗肿瘤作用可部分归因于肠道微生物群的调节和粪便短链脂肪酸的增加。有副作用的天然抗肿瘤化合物是癌症治疗辅助药物的有吸引力的替代品。因此，生物相容性植物化学物质代表了用于治疗各种癌症的有前途的辅助化疗药物。

5-氟尿嘧啶（5-fu）是结直肠癌（crc）的一线治疗药物，该药物会引起治疗相关的肠粘膜炎等不良事件，用该药物治疗的疗效有时会受到限制。越来越多的证据表明，某些植物来源化学物质具有治疗和预防癌症的特性。据报道，从天门冬科弹簧草属的虎眼万年青（albuca bracteate，ab）中提取的多糖（abp）具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤特性。虎眼万年青（albuca bracteate，ab）是一种常绿草本植物，也是一种已经被报道的可治疗肝炎、糖尿病、腮腺炎和其他疾病的草药，它具有抗肿瘤、抗氧化、抗糖尿病和抗炎作用。ab多糖（abp）可能是医药和功能性食品中抗氧化剂和免疫刺激剂的良好候选物。然而，除了一项证明 abp 治疗抑制鼠 s180 肉瘤生长的研究外，很少有研究关注 abp 的特定抗肿瘤特性。此外，据我们所知，没有研究探讨过 abp 治疗在胃肠道肿瘤中的作用。

在本研究中：小鼠crc细胞（ct26）和crc小鼠模型用于研究abp的抗肿瘤特性，以及abp和5-fu之间协同相互作用的潜在机制的探索。作者的研究结果表明：abp可以抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移；体外和体内通过抑制β-连环蛋白信号传导来抑制肿瘤。此外，联合abp和5-fu的治疗比单独使用任一药物治疗的疗效更好。此外，这种联合疗法导致肠道微生物群中瘤胃球菌属、anaerostipes属和oscillospira属的特异性富集，并增加了粪便短链脂肪酸（scfa，乙酸、丙酸和丁酸）的水平。肠道微生物群的改善和有益scfa的增加有助于提高治疗效果并减少5-fu的不良反应。总之，这些数据表明abp具有抗肿瘤活性，可以有效提高5-fu在crc治疗中的疗效。因此，进一步研究abp在开发新型抗肿瘤药物和辅助化合物中的应用是有必要的，并且可以改善crc患者的症状。

 论文id

 原名：albuca bracteate polysaccharides synergistically enhance the anti-tumor efficacy of 5-fluorouracil against colorectal cancer by modulating β-catenin signaling and intestinal flora

译名：虎眼万年青（albuca bracteate）产的多糖通过调节β-catenin信号传导和肠道菌群协同增强5-氟尿嘧啶对结直肠癌的抗肿瘤功效

期刊：frontiers in pharmacology

if：5.810

发表时间：2021.9.3

通讯作者：楼永良；蒋磊；杜季梅；

通讯作者单位：温州医科大学

doi号：10.3389/fphar.2021.736627

实验设计

结果

1 abp处理抑制crc细胞的增殖

为了探索abp处理对crc细胞的影响，我们用一系列不同浓度的abp处理ct26细胞，然后通过cck-8和edu摄取实验来测定和探索它们的增殖能力和活力。abp处理以时间和剂量依赖性方式显著地损害ct26细胞的生长（图1a），并且我们在edu摄取测定中观察到类似的结果（图1b、c）。

为了进一步阐明所观察到的结果背后的机制，我们进行了蛋白质印迹实验。结果发现：abp处理抑制了β-catenin、c-myc、cyclind1、cox-2和pcna的表达（图1d、e）。mrna水平有相应的变化（附图s1）。因此，我们的实验结果表明abp通过抑制wnt/β-catenin通路来抑制体外crc细胞的生长。

图1. abp处理抑制了crc细胞的增殖。（a）cck-8测定来检测abp对ct26细胞增殖的抑制作用。（b-c）edu摄取测定来检测abp对ct26细胞增殖的抑制作用。比例尺=50 μm（×200倍）。（d-e）蛋白质印迹来检测abp对ct26细胞中β-连环蛋白、细胞周期蛋白d1、c-myc、pcna、cox-2和gapdh蛋白质水平的影响。与未治疗组相比，*p<0.05，**p<0.01。

2 abp处理抑制crc细胞的迁移和侵袭活动

本实验中，用transwell实验检测评估abp处理对crc细胞迁移和侵袭的影响。用0.1和0.15mg/ml剂量abp处理会使迁移细胞百分比分别降低38.3±4.81%（p<0.01）和46.7±6.24%（p<0.01）。这伴随着侵袭细胞频率降低42.6±5.7%（p<0.01）和50.2±4.1%（p<0.01）（图2a、b）。与这些结果一致，伤口愈合试验显示在abp处理组中（图2c，d），abp处理将伤口愈合率从对照样品的34±3.4%降低到19±3.6%（0.1mg/ml，p<0.01）和15±3.1%（0.15mg/ml，p<0.01）。对上皮间质转化（emt）相关蛋白的蛋白质印迹分析表明，abp处理抑制了波形蛋白并增强了ct26细胞中的e-钙粘蛋白表达（图2e、f）。

 图2. abp处理抑制了crc细胞的迁移和侵袭活性。（a-b）transwell测定检测abp对ct26细胞迁移和侵袭的负面影响。比例尺=50μm。（c-d）伤口愈合试验检测abp对ct26细胞迁移和侵袭的负面影响。比例尺=250μm。（e-f）蛋白质印迹检测abp对ct26细胞中波形蛋白、e-钙粘蛋白和gapdh蛋白质水平的影响。与未治疗组相比，*p<0.05，**p<0.01。

  3 abp处理通过下调β-catenin从而抑制crc细胞的生长和转移

鉴于我们上述结果中的abp抑制β-catenin及其相关蛋白的表达这个发现，我们推测β-catenin是ct26细胞中abp的重要抗肿瘤靶点。为了验证这一假设，我们使用了β-catenin的激动剂skl2001来操纵β-catenin的活性。我们在体外检测了有或没有skl2001的abp处理对ct26细胞的影响，并随后进行了分析。结果表明：skl2001逆转了abp诱导的β-catenin下调（图3a，b）并部分减弱了abp诱导的crc细胞增殖抑制（图3c，p<0.01），skl2001也明显逆转了abp对crc细胞增殖的抑制作用肿瘤细胞迁移（p<0.01）和侵袭（p<0.05）（图3d、e）。这些数据表明：abp作为β-catenin抑制剂并抑制crc细胞的迁移、侵袭和生长，至少部分是通过下调β-连环蛋白。

图3. abp处理通过下调β-catenin从而抑制crc细胞的生长和转移。（a–b）蛋白质印迹检测skl2001（β-连环蛋白激活剂）对abp处理的ct26细胞中β-连环蛋白、c-myc和细胞周期蛋白d1水平的影响。（c）cck-8测定检测skl2001处理对用abp处理的ct26细胞的拯救效果。（d-e）检测skl2001处理对abp处理的ct26细胞的拯救作用的transwell测定。比例尺=50μm。与abp组相比，*p<0.05，**p<0.01。

  4 abp和5-fu对ct26细胞具有协同抗肿瘤功效

我们将β-连环蛋白抑制剂xav939用以评估β-连环蛋白在细胞对5-fu反应中的作用。随后的分析表明，在1μg/ml（p<0.01）和2μg/ml（图4a，p<0.01）的剂量下，xav939增强了5-fu对ct26细胞的胞毒作用。我们还使用了2种对β-catenin具有特异性的sirna来降低ct26细胞中β-catenin的表达（附图s2）。该结果表明β-连环蛋白表达降低可能增强5-fu的化疗功效。然后我们探讨了abp（0.15mg/ml）和5-fu（0-10μg/ml）对ct26细胞的综合作用。cck-8检测显示联合处理组的存活率显著低于abp或5-fu单独处理组的存活率（图4b、c）。通过使用在线软件synergyfinder（https://synergyfinder.org/）和compusyn（http://www.combosyn.com/）检测药物组合的效果。hsa协同得分（16.05），loewe协同评分（10.67）和组合指数（ci）（0.7至1.0）表明abp和5-fu在体外具有轻微的协同作用（附图s3）。

我们还评估了联合处理对ct26细胞转移能力的影响。与单独使用5-fu相比，联合处理使迁移和侵袭能力分别显著降低了38.3±0.8%（p<0.01）和47.3±5.3%（p<0.01）（图4d）。此外，联合处理将伤口愈合率从5-fu的24±2.5%降低到14±1.6%（图4e，p<0.01）。蛋白质印迹显示，联合处理细胞中β-catenin、cyclind1、c-myc、cox-2、pcna和vimentin的表达水平均低于单独处理5-fu的细胞，而e-cadherin的表达更高（图4f）。这些数据表明abp与5-fu对crc肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭具有协同作用。

 图4. abp增强了5-fu对ct26细胞的抗肿瘤功效。（a-b）cck-8检测xav939（β-连环蛋白抑制剂）和abp对5-fu对ct26细胞的抗肿瘤功效的影响。（c）用abp、5-fu和abp 5-fu处理24小时的ct26细胞的细胞形态。比例尺=50μm。（d）transwell检测abp对5-fu对ct26细胞的抗肿瘤功效的增强作用。比例尺=50μm。（e）伤口愈合试验检测abp对5-fu对ct26细胞的抗肿瘤功效的增强作用。比例尺=250μm。（f）蛋白质印迹检测用abp和5-fu处理的ct26细胞中β-连环蛋白、细胞周期蛋白d1、c-myc、cox-2、pcna、波形蛋白、e-钙粘蛋白、gapdh的蛋白质水平。与5-fu组相比，* p <0.05，** p <0.01，n.s.，没有意义。   5 abp和5-fu在荷瘤小鼠中表现出协同抗肿瘤功效

在皮下结直肠癌的balb/c小鼠模型中评估了abp的体内抗肿瘤功效。abp处理显著损害肿瘤生长（图5a-c）；abp组的平均肿瘤重量（1.440±0.401g）显著低于对照组（2.389±0.228g，p<0.001）（图5b、c）。此外，联合处理组的平均肿瘤重量（0.449±0.119g）也远低于5-fu治疗组（0.781±0.151g，p<0.01）（图5b、c）。

蛋白质印迹显示abp处理降低了肿瘤组织样本中β-连环蛋白、细胞周期蛋白d1和c-myc的表达水平（图5d）。ihc染色显示abp处理降低了肿瘤细胞中的ki-67表达（图5e）。在5-fu治疗的组中观察到显著的体重减轻（图5f，p<0.01），但5-fu和组合组之间没有统计学差异。5-fu组的脾体重比最低（3.936±1.071），联合处理组的脾体重比明显更高（6.626±1.311）（图5g，p<0.01）。这些数据表明，abp单独使用时对ct26荷瘤小鼠产生抗肿瘤作用，并在与5-fu组合时提供协同抗肿瘤作用。

图5. 在携带ct26肿瘤的小鼠中，abp与5-fu联合给药时表现出协同抗肿瘤作用。（a）在指定时间点测量的肿瘤体积。数据显示为平均值±sd（每个时间点n=6只小鼠）。（b）在治疗期结束时从处死的小鼠身上切除的肿瘤图像。（c）手术切除肿瘤后测量的肿瘤重量，表示为平均值±sd。（d）蛋白质印迹检测皮下肿瘤中β-连环蛋白、细胞周期蛋白d1和c-myc的水平，gapdh用作内部对照。（e）肿瘤细胞中ki67免疫组织化学染色（×400）的图像和ki67阳性肿瘤细胞的定量。比例尺=50μm。（f）每2天测量一次体重。（g）器官指数计算为治疗期结束时器官重量（mg）与体重（g）的比率。数据是平均值±sd（n=6）。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

6 abp和5-fu治疗可改善crc小鼠模型中肠道菌群的组成

为了探讨abp的抗肿瘤作用是否与肠道菌群的变化有关，治疗后对粪便菌群进行16srrna基因测序，并在操作分类单元（out）水平上评估物种多样性。联合处理组比5-fu单独组具有更高的alpha多样性（faith_pd指数 [p=0.032]，chao1指数 [p=0.095]）（图6a，b，附表s1），表明联合处理有所改善肠道菌群的丰度。主成分分析（图6c、d）和主坐标分析（图6e、f）显示对照组和abp组（r=0.204，p=0.021）以及组合和5-fu组（r=0.231）之间存在明显差异（p=0.011），表明abp处理显著影响微生物组成。肠道菌群在门和科显示在图7a（附表s2）中。为了阐明微生物分类群的具体变化，我们进一步分析了四组中22个优势属的相对丰度。结果显示，在属水平上，roseburia，clostridium，anaerotruncus，bacteroides，dehalobacterium，corprococcus，prevotella和oscilospira属的相对丰度显著较高（图7b），而5-fu处理组的相对丰度最高的是肠球菌属和乳酸杆菌属。

 图6. abp处理改变了携带ct26肿瘤的小鼠肠道微生物的丰度和多样性。（a-b）阿尔法多样性分析；（a）faith_pd指数。（b）chao1指数。（c-f）β多样性分析。（c-d）主成分分析（pca）。（e-f）主要协调分析（pcoa）（每组n=6只小鼠）。

图7. abp处理改善了肠道菌群的组成。（a）基于相对丰度的门和科水平的粪便中存在的细菌分类群的条形图。（b）基于相对丰度的属级粪便中细菌分类群的热图。

图8. abp处理导致有益细菌的富集并影响代谢途径。（a-b）使用lefse分析观察到的四组之间的细菌分类群差异。（c）箱线图展示了科、属和种水平的特征细菌。（d）组间功能代谢途径的差异。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

为了进一步确定作为不同群体生物标志物的微生物分类群，我们进行了线性判别分析（lda）和效应大小测量（lefse）。每组的生物标志物按效果大小排序（p=0.05，lda得分>2）如图8a、b所示。为了进一步阐明abp调节的分类群，应用kruskal-wallis检验来分析四组之间的差异。与5-fu组相比，联合处理组某些产生scfa的细菌（f_ruminococcaceae、g_ruminococcus、g_anaerostipes、g_oscillospira、g_parabacteroides）的相对丰度较高，而某些潜在致病性、促炎症细菌（f_staphylococcus，g_staphylococcus，s_staphylococcussciuri，s_ruminoccocusgnavus）。此外，与对照组相比，abp处理组的某些产生scfa的细菌（g_alistipes、g_roseburia）的相对丰度较高，而潜在的致病菌（g_ralstonia、g_staphylococcus、s_staphylococcussciuri）（图8c，附表s3）的丰度较低。

与5-fu组相比，参与pwy-7373（去甲基甲萘醌-6生物合成的超级途径ii）、pwy-7013（l-1，2-丙二醇降解）、ppgppmet-pwy（ppgpp生物合成）的细菌的相对丰度和codh-pwy（还原性乙酰辅酶a途径）途径较高。相比之下，联合处理组的pwy-2941（l-赖氨酸生物合成ii）途径低于5-fu组（图8d，附表s4）。这些数据表明，abp处理可能会改善5-fu引起的生态失调，联合处理可以部分通过增加有益菌水平和改善代谢物组成来增强5-fu的治疗效果。

7 abp处理可改善crc小鼠模型中的粪便scfa水平

为了阐明abp处理对肠道菌群代谢活动的积极影响，使用气相色谱-质谱法（gc-ms）测量粪便scfa的浓度。pcoa和plsda分析表明5-fu处理导致不同的粪便scfa组成分布（图9a、b）。我们根据所检测的数据生成了热图。如图9c所示，5-fu治疗组中每种有益scfa的浓度低于其他两组。从积极影响的角度来看，联合处理提高了所有有益的scfa，尤其是丁酸（图9c）。与5-fu治疗组比，联合处理组中乙酸（p<0.01）、丙酸（p<0.05）、丁酸（p<0.05）、戊酸（p<0.01）和己酸（p=0.13）的浓度较高。相比之下，浓度5-fu治疗组中异戊酸（p<0.01）和异丁酸（p=0.23）的浓度更高（图9c、d，附表s5）。这些数据表明5-fu耗尽了最有益的scfa，abp处理可以提高ct26荷瘤小鼠粪便中有益scfa的水平。

 图9. abp处理提高了crc模型小鼠的粪便短链脂肪酸浓度。（a-b）pcoa和pls-da分析。（c-d）粪便scfa含量的热图和条形图。*p<0.05，**代表p<0.01。

讨论

crc是美国癌症相关死亡的第二大原因，也是全球第三大常见癌症。自1950年代以来，5-fu的使用一直是crc治疗的标准方法，基于5-fu的化疗仍然是crc，尤其是转移性crc的主要方法。然而，除了严重的免疫抑制作用和药物毒性外，5-fu治疗还会导致原发性和继发性化学耐药性。鉴于癌症造成的巨大损害和化学耐药性的不断出现，需要新的药物和抗肿瘤治疗。此外，将常规化学治疗剂与天然化合物结合使用以提供协同抗肿瘤作用也可能大有帮助。

天然产物已作为重要的抗肿瘤剂并已开发用于临床。此外，具有很少或没有副作用的抗肿瘤化合物有望作为癌症治疗中的药物替代品或辅助剂。许多植物来源的化合物，如丹参酮、姜黄素和灵芝多糖因其广谱抗肿瘤作用和高效能而备受关注。

由于其广泛的抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗菌和抗糖尿病特性，植物多糖一直是深入研究的重点。ab是一种治疗肝炎、糖尿病和多种癌症的草药，几十年来已在中国某些地区用于中医。植物化学检测证实，ab具有广泛的生物活性特性，因为它含有各种皂苷、多糖、黄酮类化合物和胆甾烷苷。考虑到ab的中药制剂通常是煎剂并口服给药，并且考虑到ab含有高水平的潜在益生元多糖，我们推测abp可能有助于ab的抗肿瘤作用。在检验这一假设时，我们发现abp处理有效地抑制了体外crc细胞的生长、迁移和侵袭。在体内抑制皮下肿瘤生长。

crc发展是一个复杂的多步骤过程，涉及wnt/β-catenin、hedgehog、notch、tgf-β、jak-stat和ras-raf-mapk通路的异常。在估计90%的crc肿瘤中，异常wnt/β-catenin通路激活是明显的，因此该通路被认为在此类肿瘤的发展和恶性生长中起着核心作用。经典wnt信号通路的异常激活导致高水平的β-连环蛋白，驱动emt诱导和癌症干细胞发育，从而增强crc肿瘤的整体恶性程度。cyclind1和c-myc是β-catenin信号通路的下游成员，它们的过度表达会导致增殖和恶性转化增强。此外，高c-myc表达也与crc患者较差的长期结果相关。emt流程与肿瘤细胞侵袭和转移密切相关，其特征是e-钙粘蛋白下调和n-钙粘蛋白和波形蛋白表达升高。

我们发现abp处理抑制了β-catenin和相关蛋白的表达，包括c-myc、cyclind1、pcna、cox-2和波形蛋白，并以剂量依赖性方式升高e-钙粘蛋白水平。β-连环蛋白对于wnt/β-连环蛋白信号传导至关重要。鉴于skl2001可逆转abp诱导的β-catenin下调和细胞增殖，我们得出结论，β-catenin是ct26细胞中abp的关键靶点，并且至少部分通过下调β-catenin和改变下游基因的表达。

对5-fu的化学抗性仍然是crc治疗的主要障碍。德雷伯等人。据报道，具有高水平β-连环蛋白的crc患者对5-fu治疗的敏感性较低。与之前的报告一致，在我们的研究中，用β-catenin抑制剂xav939治疗证实抑制β-catenin信号传导足以提高敏感性crc细胞转化为5-fu。我们进一步探讨了abp和5-fu联合处理对ct26细胞的影响。体外结果表明，联合处理比单独使用abp或5-fu治疗提供更好的抗肿瘤功效。而进一步分析表明abp和5-fu显示出较小的协同作用（附图s3）。鉴于多糖的益生元潜力，我们推测联合处理在体内的疗效会更好。我们发现，在结直肠癌小鼠模型中，联合处理的抗肿瘤疗效显著。优于5-fu或abp单药治疗。此外，联合处理组的脾脏指数高于5-fu治疗组的小鼠（图5b、c、g）。此外，在联合组中观察到抑制期（4天）的惊人延长（图5a），而在5-fu治疗组停止化疗后肿瘤增殖很快恢复。

为了揭示abp对体内crc影响的多种机制，进行了蛋白质印迹分析。我们检测了参与wnt/β-catenin信号通路的蛋白质的变化，结果证实了我们的体外发现。各种因素导致crc的发生，包括饮食、药物摄入和环境条件，所有这些都会影响肠道微生物群的组成、功能和产生代谢产物的能力。数十亿细菌存在于人类结肠内，它们在宿主与特定药物反应和功能性营养素之间充当重要桥梁，导致正常的体内平衡和与生态失调相关的病理状况，例如炎症性肠病。

多糖可改善癌症患者的免疫反应和化学敏感性，多糖的抗肿瘤作用部分是由于它们调节肠道微生物群和促进粪便scfa水平。在结肠中，scfa作为上皮细胞的重要能量来源，可以调节结肠内的关键炎症过程以维持正常的宿主生理。因此，我们分析了粪便微生物组组成和粪便scfa浓度，以阐明abp的抗肿瘤功能。16s rrna测序结果发分析显示，abp处理组的粪便样本中富含瘤胃球菌属、厌氧菌属、oscillospira、alistipes和roseburia。这些细菌是短链脂肪酸的潜在生产者。数据还表明，ab抑制某些致病性炎症促进细菌（g_staphylococcus、s_staphylococcus sciuri、s_-ruminoccocus gnavus）的生长。很明显，abp处理在一定程度上改善了5-fu诱导的生态失调，并改善了crc模型小鼠的肠道菌群组成。丁酸是肠道中至关重要的scfa，它可以杀死crc细胞并抑制其迁移。gc-ms结果显示abp可以增加用5-fu治疗的小鼠中一些有益的scfa（乙酸、丙酸和丁酸）的水平。本研究中粪便scfa水平的变化与肠道微生物组组成的变化一致。因此我们推测，除了促进β-catenin下调外，abp还通过增加产生scfa的细菌的丰度和有益scfa的水平来促进体内抗肿瘤作用。肠道微生物组和相关代谢物的这种改善，反过来产生可能逆转5-fu诱导的免疫抑制和生态失调。总之，我们的数据表明abp单独处理或与5-fu联合处理可以降低crc细胞中β-连环蛋白和相关蛋白的表达。abp处理通过促进β-catenin下调、改善肠道菌群组成和提高粪便scfa水平，协同增强5-fu的抗肿瘤功效（图10）。结果表明，abp可能是增强化疗疗效的有利抗癌剂。

图10. 描述abp作为crc进展调节剂的作用机制的示意图。abp通过影响wnt/β-catenin信号通路抑制crc细胞增殖、迁移和侵袭。abp处理进一步增加了crc细胞对5-fu的敏感性，从而降低了5-fu相关不良反应的发生率。abp，albuca bractateate 多糖；crc，结直肠癌。
我们的研究表明，abp是一种潜在的的抗癌药物，有可能作为一种有价值的化疗辅助剂用于crc的临床治疗。但是，该研究存在一些局限性。首先，尽管我们的数据表明β-连环蛋白信号传导参与了abp的抗肿瘤作用但是仍需要进一步的临床前研究来评价abp的药理作用。其次，目前的研究中abp的抗肿瘤作用仅针对一种鼠结肠癌细胞系ct26进行。abp对人crc细胞系的体外和体内模型的影响和潜在机制仍需深入研究。