学术先声丨结直肠癌西妥昔单抗治疗耐药和转移的新线索mir100hg调控回路研究-k8凯发

本期《学术先声》栏目分享空军军医大学西京医院卢瑗瑗教授、赵晓迪教授和樊代明院士研究团队与先声诊断科研团队近期合作发表在molecular cancer（if=27.401）上的一篇研究[1]。研究团队前期研究（nature medicine, 2017）发现一种长链非编码rna（lncrna）——mir100hg，其内嵌基因mir-100和mir-125b是结直肠癌西妥昔单抗耐药潜在标志物。在本研究中，团队发现 mir100hg可以不依赖microrna，而是通过与m6a识别蛋白（reader）hnrnpa2b1相互作用的形式来调控结直肠癌细胞的西妥昔单抗耐药抵抗和肿瘤转移能力。这种相互作用，可以通过调控m6a修饰，增强wnt信号通路下游效应分子tcf7l2的mrna稳定性，从而上调wnt通路的转录活性；并且tcf7l2反过来也可以激活mir100hg转录，从而形成mir100hg/hnrnpa2b1/tcf7l2的正反馈调控回路。本研究揭示了结直肠癌西妥昔单抗治疗耐药、上皮间质转换（emt）、肿瘤转移的表观遗传学原因，并为之提供了潜在的治疗靶点。

研究背景

结直肠癌（colorectal cancer, crc）是全球第三大新发癌种，也是肿瘤相关死亡的第二大因素，耐药和肿瘤转移是其不良预后的主要原因。因此研究肿瘤细胞的耐药和转移机制，对于提高患者预后生存率至关重要。研究表明，动态生物学过程上皮-间充质转化（emt）通过将上皮肿瘤细胞转变为间充质表型，从而可以增强肿瘤的耐药性和转移能力。而lncrnas 是emt的关键调节因子，并且高度参与n6-methyladenosine（m6a）加工的所有步骤。最新研究发现lncrnas mir100hg，也被称为mirna的宿主基因（lnc-mirhg），可以通过促进rna结合蛋白hur与其靶向mrna之间的相互作用来调节细胞周期从而促进肿瘤进展，也是结直肠癌西妥昔单抗耐药潜在标志物。但其作用机制是否emt过程以及是否由m6a介导参与等问题尚不清楚。

研究结果

1.  mir100hg通过emt过程影响crc的耐药和转移

研究者首先通过细胞实验，从人类细胞系hca-7中产生西妥昔单抗敏感的cc细胞和耐药的cc-cr细胞。并在3d培养中发现cc细胞呈现极化结构，而cc-cr细胞则截然相反，失去顶基底极性表现出无组织结构。接着通过免疫荧光发现与cc细胞相比，cc-cr细胞的e-cadherin-mediated粘附连接缺失而emt相关蛋白显著增加，以上特征均表明在cc-cr细胞中发生emt过程。转录组数据分析发现与cc细胞相比，cc-cr细胞中mir100hg是最显著上调基因，并且在crc公共数据集中（n=2375），mir100hg和emt通路富集评分高度正相关(r=0.764，p<0.0001)，并在高表达的crc肿瘤组织中emt-hallmark通路显著富集。为了进一步证明mir100hg与emt之间的作用关系，研究者通过基因敲除模型，发现在过表达的mir100hg cc细胞中e-钙粘蛋白表达减少，间充质基因和emt-tfs表达增加。这些结果强烈表明，emt过程是crc耐药和转移的重要因素，并且mir100hg表达在crc中可以诱导emt的发生。

图1. crc中mir100hg对emt的调控

为了进一步证明mir100hg与crc转移和耐药的关系，研究者首先在29个crc细胞系上进行西妥昔单抗药物实验，发现在间充质组细胞系（cms4）上，表现出更明显的耐药反应。基因敲除模型发现，敲除mir100hg的cc-cr细胞（mir100hgkoe4）菌落数目在西妥昔单抗药物环境下显著减少，而恢复全长后则消除了对西妥昔单抗的敏感。为了确定上述结果是否可以在体内重现，研究者通过荧光素酶和小鼠皮下注射体内实验发现在mir100hgkoe4小鼠上荧光信号以及肿瘤体积和重量均显著降低，并且免疫组化（ihc）染色也表明在mir100hgkoe4肿瘤组织中含有较少的ki-67阳性细胞和较多分裂的caspase-3阳性细胞。以上结果均证明mir100hg对维持西妥昔单抗耐药性和增强crc肿瘤转移侵袭能力非常重要。

图2.  mir100hg促进crc细胞西妥昔单抗耐药和转移

2.  mir100hg通过结合hnrnpa2ba并依赖m6a来调控tcf7l2稳定性

研究表明，lncrnas是通过与rna结合蛋白的相互作用来进行生物过程调控。研究者通过结合rna纯化（chip）和质谱分析技术，发现hnrnpa2b1是mir100hg最显著的结合蛋白之一，并且该蛋白也是重要的emt调控因子。接着通过rna结合蛋白免疫沉淀（rip）技术对结果进行验证后，研究者使用rnafold web server分析和生物素标记技术进一步确定了mir100hg与hnrnpa2b1的具体结合区域。并通过基因敲除细胞模型发现，hnrnpa2b1在crc中有着与mir100hg的相同作用，都可以促进肿瘤细胞的耐药产生和迁移侵袭。

图3.  hnrnpa2b1可以直接、功能性结合mir100hg

然而，基因敲除模型发现mir100hg的过表达或敲除均不影响crc细胞中hnrnpa2b1的表达水平。鉴于hnrnps与前体mrna的加工和代谢相关，研究者通过在沉默mir100hg/hnrnpa2b1后进行rna测序，结果找到tcf7l2基因是两组差异分析结果当中唯一一个均显著下调的基因。并且过表达的tcf7l2可以阻止mir100hg或hnrnpa2b1缺失crc细胞的耐药性和转移作用。通过放线菌素d处理以及基因敲除模型，验证了mir100hg与hnrnpa2b1的结合是稳定tcf7l2 mrna的关键因素。因为hnrnpa2b1是核内m6a依赖性的rna加工介质，而merip分析表明tcf7l2 mrna也是通过m6a修饰来增强其稳定性的，因此研究者通过体内rna沉淀分析和荧光素酶报告技术证明了hnrnpa2b1与tcf7l2之间的相互作用是依赖于m6a的参与。最后，研究者使用基因敲除模型和tcf/lef1荧光素酶报告，验证了mir100hg/hnrnpa2b1/tcf7l2调控轴，并且该调控方式是通过wnt通路作用来对crc耐药和转移产生作用。

图4. mir100hg和hnrnpa2b1协同调控tcf7l2的mrna稳定性并激活wnt信号通路

3.  tcf7l2可激活mir100hg转录形成正反馈调控回路

研究者通过jaspar数据库分析发现mir100hg启动子有四个tcf7l2的结合位点，并通过细胞系实验证明tcf7l2是mir100hg转录的最重要调控因子。接着，研究者通过荧光素酶报告实验和染色质免疫沉淀（chip）分析证明tcf7l2也是激活mir100hg转录的重要因子。并且在crc细胞系以及tcga数据库中，tcf7l2和mir100hg表达之间存在显著正相关性。结果证明，mir100hg和hnrnpa2b的相互结合可以增强tcf7l2mrna的稳定性，而tcf7l2通过转录激活又可以进一步提高mir100hg丰度，形成一条mir100hg/hnrnpa2b1/tcf7l2正反馈调控回路。

图5. tcf7l2和mir100hg在crc细胞中形成正反馈回路

4.  crc样本中mir100hg、hnrnpa2b1和tcf7l2的表达相关性 

最后，研究者从12对西妥昔单抗治疗前和进展中crc患者上获得肿瘤组织样本，并进行rnascope染色和ihc染色，结果表明与治疗前相比，西妥昔单抗治疗进展组中mir100hg，hnrnpa2b和tcf7l2表达均显著升高，并且三者之间存在明显的正相关性。14对原发性结直肠癌组织、邻近非肿瘤组织和匹配的淋巴结或远处转移样本的ihc染色结果同样表明，在淋巴结和远处转移的肿瘤组织中mir100hg、hnrnpa2b1和tcf7l2表达显著增加，并且也存在正相关关系。

图6. mir100hg/hnrnpa2b1/tcf7l2在crc标本中的协同表达

讨论

该研究通过体内外实验结合临床患者自测数据及公共数据分析，在emt依赖性结直肠癌西妥昔单抗耐药和肿瘤转移机制上中揭示出一个新的mir100hg/hnrnpa2b1/tcf7l2 正反馈调控回路。研究证明了mir100hg与hnrnpa2b1相互作用是以m6a依赖的方式来介导tcf7l2 mrna的稳定，而tcf7l2又可以激活mir100hg的转录，从而形成正反馈调控回路。该发现有重要的潜在靶向治疗应用价值，有可能通过开发针对mir100hg的靶向治疗，来治疗结直肠癌西妥昔单抗耐药和转移。而emt在免疫抑制、免疫逃逸和免疫治疗耐药中也有关键作用。将mir100hg的靶向干预与免疫检查点抑制剂相结合可能是未来提高crc患者免疫治疗疗效的潜在策略。 

end 

参考文献：

[1]  liu h, li d, sun l, qin h, fan a, meng l, graves-deal r, glass se,franklin jl, liu q, wang j, yeatman tj, guo h, zong h, jin s, chen z, den g t,fang y, li c, karijolich j, patton jg, wang x, nie y, fan d, coffey rj, zhao x,lu y. interaction of lncrna mir100hg with hnrnpa2b1 facilitates m6a -dependentstabilization of tcf7l2 mrna and colorectal cancer progression. mol cancer.2022 mar 12;21(1):74. doi: 10.1186/s12943-022-01555-3. pmid: 35279145; pmcid:pmc8917698.

撰写丨阿晖

编辑、排版丨sx